当前位置:主页 > 尖锐湿疣治疗 >

已阅读
110次

尖锐湿疣有哪些检查诊断方法

文章来源:南京圣贝医院 撰写作者:尖锐湿疣医生

  尖锐湿疣的诊断多根据皮疹特点、发病部位、发展情况结合可能询及的接触史来判断,但少数病人要进行一些辅助实验来确诊。具体实验诊断方法介绍如下:

  一、醋酸白试验

  用3-5%醋酸外涂疣体2-5分钟,病灶部位变白稍隆起,肛门病损可能需要15分钟。本试验的原理是蛋白质与酸凝固变白的结果,HPV感染细胞产生的角蛋白与正常的未感染上皮细胞产生的不同,只有前者才能被醋酸脱色。醋酸白试验检测HPV的敏感性很高,它比常规检测观察组织学变化还好。但偶尔在上皮增厚或外伤擦破病例中出现假阳性、假阳性变白迹象显得界限不清和不规则。美国CDC提示,醋酸白试验并不是特异试验,且假阳性较常见。

  二、免疫组织学检查

  常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法(即PAP),显示湿疣内的病毒蛋白,以证明疣损害中有病毒抗原。HPV蛋白阳性时,尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应。

  三、组织化学检查

  取少量病损组织制成涂片,用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。如病损中有病毒抗原,则抗原抗体结合。在过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)方法中,核可被染成红色。此法特异性强且较迅速,对诊断有帮助。

  四、病理检查

  主要为角化不全,棘层高度肥厚,乳头瘤样增生,表皮突增厚,延长,其增生程度可似假性上皮瘤样。刺细胞和基底细胞并有相当数量的核分裂、颇似AI-G变。但细胞排列规则,且增生上皮和真皮之间界限清楚。其特点为粒层和刺层上部细胞有明显的空泡形成。此种空泡细胞较正常大,胞浆着色淡、中央有大而圆,深嗜碱性的核。通常真皮水肿、毛细血管扩张以及周围较致密的慢性炎性浸润。Bushke-loewenstein巨大型尖锐湿疣,表皮极度向下生长,代替了其下面的组织、易与鳞状细胞相混,故须多次活检。若有缓慢发展之倾向,则为一种低度恶变的过程,即所谓疣状AI-G。

  五、基因诊断

  迄今,HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测,主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点,为HPV检测开辟了新途径。

  (一)标本的采集及处理

  1.标本的采集和预处理:用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。在作细胞学检查的同时,将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中,用PBS离心(3000g,10min)洗涤2次,沉积细胞重悬于1mlPBS中,取0.5ml细胞悬液抽提。

  2.标本核酸的提取:按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液(10mmol/LTris-HCl,pH7.4,10mmol/LEDTA,150mmol/LNaCl,0.4%SDS,1.0mg/ml蛋白酶K)37℃下处理过夜;且等体积酚/氯仿(1:1),氯仿/异戊醇(24:1)各抽提2次;加1/10体积3mol/LNaAc(pH5.2)及2.5倍体积无水乙醇置-20℃2h或过夜沉淀DNA;加1体积乙醇洗涤1次;用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,1.0mmol/LEDTA)溶解DNA,37℃温育。

  (二)PCR扩增

  1.引物设计和合成:HPV基因组可分为早期区(E)和晚期区(L),每区含一系列开放读码框架(ORF)。序列分析表明,各型HPV的非编码区及E1、E6、E7和L1区均有保守序列。Manos等从HPVL1区中选择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1,该引物与HPV6、11、16、18及33型有互补序列,也可扩增其它型。

  2.PCR反应试剂:TaqDNA聚合酶(2U/ml)、10mmol/LdNTP贮备液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L),10×PCR缓冲液(500mmolKCl、40mmol/LMgCl2、100mmol/LTris-HCl、pH8.5),100μmol/LMY11和MY09贮备液,灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。

  3.PCR扩增方法和程序:以100μlPCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。

  (1)实验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂。每支反应管中含有的PCR反应试剂。

  (2)各反应管依次加入10μl标本和90μl预混反应试剂。

  (3)加入80-100μl石蜡油,在台式离心机上快速离心数秒钟,使各反应试剂收集于油层下。目前,PCR试剂已商品化,反应体积为25μl。使用时只加入标本DNA即可。

  (4)将反应管置PCR扩增仪上,循环参数为95℃30s,55℃40s,72℃50s循环35次,最后72℃延伸5min。

  4.每次试验应设阳性及阴性对照。以载有HPV的重组质粒(每反应为100pg)或含有HPV的细胞系(如癌ski、HeLa)DNA为阳性对照,以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照。

  (三)扩增产物的检测和分析

  1.凝胶电泳:扩增反应结束后,取出反应管,冷却至室温,取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳,溴化乙锭染色,紫外分析仪下分析结果,分子量约为450bp处出现明显的DNA带。

  2.核酸杂交:如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时,可用标记的公用混合探针和(或)型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。

  按照标准方法制32PATP标记的寡核苷酸探针,需达到约107cpm/pmol特异活性。杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml。在55℃缓慢振荡下杂交2-3h,随后于30-55℃下用洗涤液(2×SSC、0.1%SDS)迅速冲洗杂交膜,除去多余探针。然后进行洗膜,其条件依所用探针而异:公用混合探针,55℃洗膜10min;MY12、MY13及MY16探针,56-57℃下10min,并换液重洗1次;MY14及WD74探针,58-59℃下10min,亦换液重洗1次。

  用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越。其敏感性高,GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果,可检出标本中200个拷贝的HPVDNA,若以核酸杂交检测PCR产物,敏感性提高,能检出10个拷贝的HPVDNA。

  鉴于PCR技术的高度敏感性,以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求,避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下,PCR扩增产物经凝胶电泳,观察产生的DNA可直接作出诊断。因此,PCR技术检测HPV实验周期短、简便快速。

  (实习编辑:谢敏华)

                                   
----------------------------------------------------------------------------------

地址:南京市秦淮区晨光路108号-1

健康热线:4008551120

南京圣贝尖锐湿疣医院 ©版权所有 抄袭必究

南京圣贝官方微信